هدف از این رساله بررسی امکان طراحی روش RT – PCR برای تشخیص ازدیاد بیان ژنی ژن HER2 در نمونه های توموری بدخیم پستان می باشد
هدف از این رساله بررسی امکان طراحی روش RT – PCR برای تشخیص ازدیاد بیان ژنی ژن HER2 در نمونه های توموری بدخیم پستان می باشد
رساله دکترای رشته پزشکی
بررسی امکان طراحی روش RT – PCR برای تشخیص ازدیاد بیان ژنی ژن HER2 در نمونه های توموری بدخیم پستان
چکیده:
سرطان پستان از شایع ترین سرطان های زنان است که سبب مرگ زنان زیادی می شود. موتاسیون های بسیاری نظیر ازدیاد آنکوژن ها و یا حذف ژن های سرکوبگر تومور در این سرطان شناسایی شده اند؛ در بین آنکوژن ها، erb-B2 که به خانواده EGFR (گیرنده فاکتور رشد اپیدرمی) تعلق دارد در 30%-25% تومورهای پستان با منشاء سلول های داکتال ازدیاد پیدا می کند. (80% سرطان های پستان منشا داکتال دارند.)در بیمارانی که erb-B2 در آن ها ازدیاد پیدا کرده بیماری می تواند تا حدی با استفاده از یک آنتی بادی مونوکلنال انسانی شده علیه محصول پروتئینی ژن erb-B2 به نام هرسپتین مهار شود.از این رو شناسایی تومورها یی که erb-B2 در آن ها ازدیاد پیدا کرده اهمیت دارد.روش روتین در شناسایی این تومورها ایمونوهیستوشیمی (IHC) می باشد.
در این مطالعه 50 نمونه از بیمارستان دی جمع آوری شد که بر اساس نتایج IHC، 32% نمونه ها ازدیاد آنکوژن erb-B2 را نشان می دادند.جهت مقایسه RT-PCR و IHC، RNA این نمونه ها استخراج شد و RT-PCR برای آن ها انجام شد که در آن دو جفت پرایمر طراحی شده به طور همزمان ژن erb-B2 را به همراه ژن بتاگلوبین به عنوان کنترل داخلی تکثیر می کردند؛ سپس محصولات RT-PCR بر روی ژل آگاروز برده شدند و شدت باند های مربوط به erb-B2 و کنترل داخلی با یکدیگر مقایسه گردید. در نهایت از مقایسه نتایج حاصله از RT-PCR با نتایج IHC مشخص شد که بازده RT-PCR در تشخیص نمونه های با درجه IHC 3+، 100% و در مورد نمونه های 2+، نیز 100% می باشد. همچنین آزمایش PCR بر روی DNA استخراج شده از بافت توموری و DNA نرمال استخراج شده از بافت فرد سالم انجام گرفت که نتایج مربوط به این آزمایش نیز نتایج بدست آمده از RT-PCR را تایید می کردند.
کلمات کلیدی:
سرطان
داکتال
آنکوژن ها
موتاسیون
سرطان پستان
سرطان های زنان
مقایسه RT-PCR و IHC، RNA
مقدمه:
در پستان نرمال، داکتها و لوبولها بوسیله دو نوع سلول فرش می شوند یک دسته سلول های مسطح که یک لایه ناپیوسته از سلول های قابل انقباض حاوی میوفیلامان ها هستند (سلول های میواپی تلیال ) و روی غشای پایه قرار دارند . این سلول ها در خروج شیر در طی دوره شیر سازی همکاری می کنند و نقش مهمی در حفظ ساختار و عملکرد نرمال لوبول ها و غشای پایه دارند (86). لایه دومی از سلولهای پوششی کف لومن را فرش کرده است ( سلول های لومینال ).
داکت های انتهایی و لوبولها شیرتولید می کنند ولی سلول های بخشهای دیگر داکت، در تولید شیر نقشی ندارند.منشأ سلول های لومینال و اپیتلیال ، سلول های بنیادی واقع در ترمینال داکت ها در نظر گرفته می شود(6). بخش اصلی بستر پستان از بافت پیوندی فیبروس متراکم مخلوط با بافت چربی تشکیل شده است که همان بستره بین لوبولی است. لوبولها بوسیله یک بستره ظریف احاطه شده اند که بافت ویژه پستان است و خصوصیات پاسخ دهنده به هورمون دارد و دارای تعدادی لنفوسیت می باشد (85).
فهرست مطالب
چکیده: 1
فصل اول:مقدمه 5
1-1- غدد پستانی 6
1-1-1- ساختار پستان نرمال 6
شکل (1-1 )- ساختار پستان نرمال (55) 7
1-1-2- تغییرات پستان در چرخه زندگی 8
1-2 -کارسینومای پستان 10
1-2-1-کارسینوما 10
1-2-2- ریسک فاکتورها 12
1-2-3- سبب شناسی سرطان پستان 16
1-2-5- سرطان پستان غیر وراثتی 19
1-2-5-1-2- تومور ساپرسورها 21
1-2-5-1-4- مسیرهای بقای سلولی و مرگ سلولی 23
1-2-5-1-4-1- تلومراز 23
1-2-5-1-4-2- ژن های وابسته به آپوپتوز 24
1-2-6-1- طبقه بندی کارسینوماهای پستان بر اساس مطالعات میکرواری (از لحاظ ملکولی) 26
1-2-6-1-1-کارسینوماهای ER- مثبت 26
1-2-6-1-2-کارسینومای های ER- منفی 26
1-2-6-1-3-کارسینوماهای Basal-like 27
1-2-6-1-4-کارسینوماهای HER2/neu- مثبت 27
شکل 1-3- نمای شماتیک خانواده HER (90) 28
1-2-7- طبقه بندی کارسینوماهای پستان از لحاظ بافت شناسی 31
1-2-7-1- کارسینوما های در جا و تهاجمی(شکل 1-6 ) 31
شکل (1-5) – کارسینوماهای درجا و تهاجمی (85) 32
فصل دوم:مروری بر مطالعات انجام شده 34
2-1- تکنیک های سنجش HER2/neu 35
2-1-1- ایمونوهیستوشیمی (IHC) 35
2-1-2- ساترن و اسلات بلات 37
2-1-3-تکنیک FISH 37
2-1-4- تکنیک CISH ) (Chromogenic in situ hybridization 38
2-1-5- تکنیک ( Enzime – linked immunosorbent assay ) ELISA 38
2-2- وضعیت HER2 و پیشگویی پاسخ به درمان با هرسپتین 40
2-3- HER2/neu فسفریله به عنوان یک مارکرپروگنوستیک و پیش گویی بالقوه 41
2-4- سنجش بخش خارج سلولی HER2 در جریان خون به عنوان تومور مارکر 41
2-5- خلاصه 42
2-2- هدف 43
فصل سوم:مواد و روشها 44
مواد و روشها 44
3-1- استخراج RNA ی كل از بافت 45
3-2- بررسی كمی و كیفی RNA ی استخراج شده 50
3-2-1- UV اسپكتروفتومتری 50
3-2-2- الكتروفورز ژل آگارز (106) 52
طرز تهیه محلول ها و بافرهای مورد نیاز در الكتروفورز : 53
محلول اتیدیوم بروماید (10 mg /ml) 54
مواد و وسایل لازم 55
جدول 3-1 – رابطه درصد ژل آگارژ با اندازه مولكول DNA 58
3-3 تیمار RNAی استخراج شده با آنزیم DNase [149] 58
طرز تهیه مخلوط dNTP از هر یك از نوكلئوتیدها 60
3-5- واكنش PCR [2] 63
3-5-1 طراحی پرایمر: 63
3-5-2- آماده سازی پرایمرهای PCR [2] 66
3-7- استخراج DNA از بافت پستانداران با استفاده از Accuprep Genomic DNA Extraction kit (Bioneer) 70
3-7-1- سنجش غلظت DNA 71
3-9- ایمنوهیستوشیمی Immunohistochemical (IHC) Techniques 73
فصل چهارم:بحث و نتایج 76
بحث و نتایج 76
4-1- نتایج 77
4-1-1- تعیین کیفیت و کمیت RNA ی استخراجی 77
4-1-2- بهینه سازی واکنش PCR 78
4-1-3- RT – PCR 80
4-2- بحث و پیشنهادات 84
4-2-1- بحث 84
4-2-2- علت انتخاب RT- PCR 85
4-2-4- پیشنهادات 87
منابع 88
